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Ocular Changes in TgF344-AD Rat Model of Alzheimer’s Disease.

28 enero, 2014

Este trabajo de un grupo de investigadores del instituto californiano de medicina regenerativa Cedars-Sinai trata de indagar en los posibles efectos oculares de la enfermedad de Alzheimer. Hasta la actualidad, ninguno de los modelos de ratón transgénico (Tg) que se han generado, ha conseguido representar fielmente la patología de los pacientes con EA. En este estudio, utilizando un nuevo modelo de rata Tg EA, Tg F344-AD, se examinan las alteraciones oculares que se producen en la EA y se intentan correlacionar con las encontradas en un grupo de retinas humanas EA postmortem.

Resumen

En este estudio se han utilizado ratas transgénicas (TG) TgF344-AD heterocigotas que coexpresan APP 695 humano (con mutaciones K595N, M596L) y PS1 con delección del exón 9.

• Para las Pruebas de Función Visual se utilizaron ratas TG de 19 meses de edad (de ambos sexos) y controles WT (tipo salvaje) emparejados por edad. Se examinaron al menos ocho ojos en cada grupo. La agudeza visual fue probada por la respuesta optocinético (OKR) en ratas TG y WT. Se grabó el umbral de luminancia del colículo superior (CS).

• Para el Análisis Histológico se utilizaron ratas de 14 y 19 meses de edad y se analizaron al menos 12 ojos en cada grupo. Las muestras se cortaron con un criostato, la retina en secciones de 10 µm y el cerebro en secciones de 30 µm. Una lamina de cada conjunto se tiñó con violeta de cresilo (CV) para evaluar la integridad de la laminación de la retina; el resto de las laminas fueron almacenadas a -40ºC para el análisis inmunohistoquímico.

Análisis Inmunohistoquímico. Para la Tinción de la placa Aβ, las secciones se bloquearon con suero de caballo al 5% (HS) con 0,25% de Triton X-100 y se incubaron con el anticuerpo primario anti-Aβ 6E10.

Imágenes de inmunofluorescencia y microscopio confocal. Las secciones de la retina se permeabilizaron y se bloquearon con 10% HS con 0,25% de Triton X-100 y después se incubaron con anticuerpos, con teñido nuclear DAPI (diamino fenilindol). Para la obtención de imágenes, las secciones de retina se montaron con un medio de montaje fluorescente (DAKO, Carpinteria, CA).

• Para la Cuantificación del número de CGR se realizó un marcado retrogrado con un trazador neuronal (fluorocromo, LLC).

• Para la Cuantificación del espesor de la coroides se tiñeron con anticuerpo de colágeno de tipo IV, al menos siete secciones de la retina de cada corte animal. Se examinaron al menos cinco ojos de ratas TG y WT.

En las Muestras de Autopsia Humanas el diagnóstico de la EA se confirmó clínicopatológicamente de acuerdo con la modificación del Consortium to Establish a Registry for Alzheimer’s Disease (CERAD) o National Institute on Aging (NIA) criterios Reagan y la clasificación de Alzheimer Braak–Braak. Ni los pacientes con EA ni los pacientes de control tenían ninguna historia de diabetes mellitus, cánceres metastásicos, enfermedades oculares, o sepsis.

• Se analizaron seis pacientes con EA (de 63, 64, 75, 80, 80 y 95 años) y seis controles de la misma edad en la autopsia (intervalo postmortem de 3 a 13 horas).

• Los mismos anticuerpos utilizados para tejidos de rata dirigidos a epitopos para el colágeno de tipo IV, RPE65, y Aβ (6E10) también fueron utilizados para los tejidos humanos.

El Análisis Estadístico se realizó con la prueba t de Student no pareada, de dos colas (se consideró significativo P <0,05).

Comentario

Estudio de depósitos de placa Aβ en cerebro y retina de rata TG. El análisis de inmunofluorescencia tras la tinción con Ac placa Aβ específicos 6E10 fue negativo en el cerebro de rata WT, en cambio, se detecto el deposito de placas Aβ en el hipocampo y en el cerebro de rata TG. Utilizando el mismo anticuerpo en la retina, no se encontró immunorreactividad en las retinas WT, mientras que se encontró la tinción de la placa senil en la capa plexiforme interna (IPL), capa plexiforme externa (OPL), y coroides, de ratas TG de 19 meses. El mismo anticuerpo se aplicó a retinas humanas postmortem de pacientes con EA y controles de la misma edad. En secciones retinianas humanas no EA prácticamente no se encontraron placas Aβ. En dos retinas de dos pacientes con EA se encontraron estructuras tipo placa, con una morfología más densa que las observadas en el cerebro de rata TG.

Valoración de la Función Visual en el modelo de rata TG. Utilizando el OKR se estudia si se altera la agudeza visual de las ratas TG de 19 meses, en relación a las ratas WT emparejadas por edad. Los umbrales de frecuencia espacial se negativizaron aproximadamente a 0,15cyc/deg en ratas TG, en comparación con 0,22cyc/deg en ratas WT, y esta diferencia fue significativa (P <0,005). La sensibilidad al contraste se incrementó en ratas TG de 19 meses (> 50%) en comparación con ratas WT (15% -18%; observación preliminar en ratas limitadas).

Para evaluar los Cambios Morfológicos en las células del EPR de la rata TG, las secciones de retina se tiñeron con el marcador específico de RPE-RPE65. En ratas WT de 19 meses las células del EPR eran planas y tenía pocas células nucleadas dobles. En comparación, en ratas TG las células del EPR mostraron hipertrofia, y se encontraron con mayor frecuencia células con núcleos dobles. En el grupo de retinas humanas no se observaron cambios en las células del EPR.

Para estudiar el Espesor Coroideo en la rata TG, se evaluó la inmunorreactividad de los vasos coroideos tras la tinción de la membrana basal con Anticuerpo – anti colágeno tipo IV. El grosor de la coroides en ratas TG de 19 meses se redujo significativamente a 36,13 +/- 1,71 µm, en comparación con 48,6 +/- 3,74 µm en las ratas WT de la misma edad (P<0,01). En retinas humanas el espesor coroideo medio disminuyó de 122,36 +/- 24,87µm a 84,75 +/- 4,35 µm con el envejecimiento en donantes de control. El espesor medio en muestras normales fue de 98,79 +/- 7,00 µm y se redujo a 73,17 +/- 8,92 µm en muestras de EA (P <0,05). Los resultados son paralelos a los de las ratas, con un adelgazamiento de la coroides en retinas de EA en comparación con controles pareados por edad.

La respuesta inflamatoria es una de las principales características que acompañan al depósito de placas Aβ en la EA, se caracterizada por la infiltración de la microglía y activación del complemento. Por ello, se ha examinado la expresión de Iba-I y CD68, los marcadores de activación general y microglía específico, respectivamente. Se detectó un aumento significativo de la inmunorreactividad Iba-I en la coroides de ratas TG. Además, la microglía activada o neutrófilos también se incrementaron significativamente en las ratas TG según las señales CD68-positivas. En el sistema del complemento, C3 es el activador clave de las vías comunes y alternativas. El marcado de inmunofluorescencia demostró que el depósito de C3 a lo largo de la membrana de Bruch aumentó en ratas TG comparado con las ratas WT pareadas por edad.

La expresión de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) por las células de Müller fue más evidente en ratas TG que en ratas WT.

Observaciones estructurales en la retina de la rata EA. En ambas ratas, TG y WT de 19 meses, se observó una pérdida desigual de fotorreceptores a lo largo de la retina. La pérdida de fotorreceptores fué más prominente en la parte periférica de la retina.

Conclusión

En este estudio se detectaron placas de Aβ en el hipocampo, la corteza, y la retina de ratas TG. También se han encontrado depósitos de placas Aβ en la retina humana y estructuras tipo placa en dos montajes retinianos EA. El depósito de Aβ en la retina puede explicar el aumento de la inflamación, la activación del complemento, y una disminución de la función visual en las ratas TG.

NO se observaron diferencias significativas en el número de CGR en ratas TG, en comparación con las ratas WT. La perdida de CGR ha sido descrita en pacientes con EA.

La agudeza visual fue menor en las ratas TG que en ratas WT de la misma edad. Morfológicamente se observó una pérdida desigual de fotorreceptores a lo largo de la retina, que se correlacionaba con los datos de registro de umbral de luminancia. No se observó la pérdida desigual de fotorreceptores en retinas EA humanas, lo que indica la limitación de este modelo de rata.

Se encontró una hipertrofia del EPR más frecuente en ratas TG de 14 y 19 meses en comparación con las ratas WT control, lo que subraya el efecto de la Aβ en la disfunción del EPR. La disfunción de las células del EPR es relevante para diversas enfermedades degenerativas de la retina, lo que ilustra la importancia del EPR para la viabilidad de los fotorreceptores. Aunque el envejecimiento también conduce a la función anormal del EPR.

Se detecto una reducción significativa en el espesor de la coroides en ratas TG y en ojos humanos EA en comparación con controles pareados por edad. Aunque los cambios de la coroides son pequeños en relación con otros síntomas más graves, pueden desempeñar un papel importante en la regulación visual y en ocasiones afectan a la función visual.

Se observó el reclutamiento de la microglía y un aumento en la concentración de factor de complemento C3 en la coroides de rata TG, en las primeras etapas de EA, lo que sugiere una respuesta inflamatoria en el sistema vascular ocular.

Este estudio investiga los cambios oculares que se producen en la EA, y dado que el ojo y el cerebro tienen características comunes en cuanto su origen embriológico, anatómico y características fisiológicas, investigar los cambios en la vascularización ocular podría ayudar a comprender los mecanismos patogénicos de la EA. Además, en un futuro lejano, podría permitir un diagnóstico precoz de la EA mediante un examen oftalmológico.

AUTOR:
Miriam Camiña Núñez.
Hospital Del Bierzo, Ponferrada

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