Resumen
Este trabajo de la Universidad de Nottingham pretende demostrar la naturaleza multipotencial de las células estromales del limbo y la córnea periférica (CELCP), de acuerdo con los criterios de la International Society for Cellular Therapy’s (ISCT’s).
Para ello se procesan los anillos corneales resultantes tras la trepanación de la córnea central, eliminando las capas epiteliales y endoteliales. El estroma se digiere enzimáticamente, se filtra y centrifuga, y la masa celular se transfiere a 7 mL de medio de cultivo M199 con suero bovino fetal, L-glutamina, anfotericina B y gentamicina. Cada 2 días se renueva el medio durante 9 ciclos y la suspensión celular final se divide en tres alícuotas para cultivo, citometría de flujo (CF) y análisis genético.
Las muestras de CF se exponen a los anticuerpos dirigidos frente a marcadores mesenquimales (CD13, CD29, CD44, CD73, CD90…), hematopoyéticos (CD11b, CD34, CD133/2…) y citoqueratinas, entre otros. Se analiza, así mismo, la capacidad de estas células para diferenciarse hacia adipocitos, osteoblastos y condroblastos. Para ello se emplean tinciones selectivas (Oil Red O, Alizarin Red y Alcian Blue, respectivamente), así como PCR cuantitativa, reconociendo en este caso genes específicos relacionados con la adipogénesis (como la sintasa de ácidos grasos), de la osteogénesis (como la proteína morfogenética 4 o BMP-4), de la condrogénesis (como el agrecano) y marcadores de queratocitos (como la aldehído deshidrogenasa o ALDH).
Como modelo validado de stem cell mesenquimal (SCM) se emplean aquellas procedentes de hígado fetal humano (SCMhf).
Las CELCP expresan originalmente marcadores de queratocitos como CD34, queratán sulfato y ALDH, no obstante, a lo largo de los sucesivos ciclos muestran un claro descenso en la expresión de CD34. En cada uno de ellos y de acuerdo con los criterios de la ISCT’s, las células son adherentes y morfológicamente indistinguibles de las SCMhf. De acuerdo también con dichos criterios, el estudio de CF confirma que ≥95% de las células expresan CD73, CD90 y CD105 (todos marcadores mesenquimales), mientras que son CD11b, CD19, CD34, CD45 y HLA-DR negativas, siendo la intensidad de dichos marcadores similar a la observada en las SCMhf. Sólo dos marcadores se expresan de forma diferencial entre ambas estirpes: CD106 aparece en ≤2% de las CELCP frente a ≥2% de las SCMhf; mientras que CD271, ausente en las CELCP, se presenta en el 6,5% de las SCMhf.
Respecto al análisis genético, en ambos tipos de células se demuestra la regulación positiva de los genes relacionados con la adipogénesis tras la adecuada estimulación. Lo mismo sucede con BMP-4 y agrecano, tras la estimulación osteogénica y condrogénica, respectivamente.
Comentario
En condiciones fisiológicas, los queratocitos son células quiescentes, siendo su principal misión asegurar la transparencia corneal, manteniendo organizadas las lamelas de colágeno y los proteoglicanos. En respuesta a diversos estímulos y noxas se activan, perdiendo la expresión de sus marcadores característicos y adoptando, de forma reversible, fenotipos fibroblásticos y miofibroblásticos.
Dado el origen embrionario del estroma corneal en la cresta neural, no parece sorprendente que sus células hayan demostrado en diferentes trabajos su capacidad para expresar tanto marcadores mesenquimales como hematopoyéticos, lo que sugiere, al menos, un cierto grado de multipotencialidad que hasta la fecha no se había podido demostrar fehacientemente. La ausencia de marcadores específicos de SCM ha dificultado el trabajo experimental, hasta la publicación en el año 2006 de los criterios mínimos de la ISCT’s para poder definir una SCM como tal: adherencia plástica, positividad para CD73, CD90 y CD105 en ≥95% de las células pero negatividad para CD11b, CD14, CD19, CD79α, CD34, CD45 y HLA-DR (≤2%); así como capacidad para realizar adipogénesis, osteogénesis y condrogénesis bajo el estímulo adecuado.
Las CELCP cultivadas muestran una pérdida progresiva de la expresión de CD34, marcador característico de los queratocitos límbicos en estado quiescente; pueden diferenciarse hacia osteoblastos, adipocitos y condroblastos y presentan además, una morfología indistinguible de las SCMhf. La mínima heterogeneidad descrita entre los marcadores de ambas células (CD271) podría ser la base y causa de las diferentes subpoblaciones celulares resultantes.
Conclusiones
Hasta la publicación de este artículo, los queratocitos no se habían caracterizado como SCM, pese a ciertos hallazgos previos que hacían sospechar este posible origen. De acuerdo con los resultados de este interesante trabajo experimental, las CELCP cumplen los criterios de multipotencialidad, no sólo a través de las siempre controvertidas evidencias histopatológicas sino también a través de las irrefutables evidencias del análisis genético, que confirman su capacidad de diferenciación adipogénica, osteogénica y sobre todo, condrogénica. El estroma límbico representa el origen de una nueva fuente de SCM y por tanto, de nuevas opciones terapéuticas.
Autora:
Raquel Salazar Méndez