Resumen
Este trabajo, elaborado por investigadores del Schepens Eye Research Institute de Harvard y de la Universidad de Oslo, explora por primera vez la influencia del tamaño y la localización de la biopsia conjuntival en la capacidad proliferativa del cultivo de células epiteliales conjuntivales.
Se realiza una excisión conjuntival a las 6 y 12 horas en la conjuntiva de ratas macho, dividiendo cada muestra en seis piezas: fórnix superior e inferior, conjuntiva bulbar superior e inferior y conjuntiva palpebral o tarsal superior e inferior. Cada una de las piezas se divide en fragmentos de menor tamaño, obteniéndose un total de 36 explantes por cada animal. Cada uno de éstos se cultiva a 37º en un medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal, L-glutamina y antibiótico, durante 8 días. Para cada uno de los explantes se analiza el crecimiento de los cultivos mediante el software ImageJ acoplado al microscopio de fluorescencia, relacionando dicho crecimiento con el tamaño del explante. Por su parte, la capacidad de expansión clonal de las células epiteliales se exploró mediante la eficiencia de formación de colonias (colony-forming efficiency o CFE), definiendo la colonia como un grupo de ocho o más células contiguas. Finalmente, se realizó una inmunohistoquímica (IHQ) para determinar la presencia de células indiferenciadas con alto índice de proliferación, empleando para ello anticuerpos frente a p63 y PCNA (proliferating cell nuclear antigen).
Al cabo de 8 días, los cultivos procedentes del fórnix superior e inferior mostraron un mayor tamaño con respecto a aquellos procedentes de otras localizaciones. El tamaño del explante se correlacionó positivamente con el tamaño final del cultivo, independientemente de su procedencia anatómica. No obstante, aunque los explantes más grandes mostraron un mayor tamaño, la tasa de crecimiento del cultivo fue proporcionalmente mayor y por tanto, más efectiva, en los más pequeños. Respecto al CFE, el mayor porcentaje (3.6%) se observó en las células procedentes del fórnix superior, mientras que el fórnix inferior presentó una baja proliferación clonal. Finalmente, el tamaño del explante se correlacionó positivamente tanto con el porcentaje de células p63+ como PCNA+.
Comentario
Son muchos los avances conseguidos en los últimos años en materia de reconstrucción de la superficie ocular. Quizás uno de los más importantes haya sido lograr aislar, cultivar y expandir las células epiteliales conjuntivales, así como emplear con éxito estos tejidos en diferentes patologías. La principal ventaja de la expansión ex vivo de células conjuntivales frente al autoinjerto radica en limitar el daño sobre el tejido donante, especialmente cuando el defecto a cubrir es muy extenso. Son muchas las variables que parecen afectar al fenotipo de estas células (tiempo, medio de cultivo…) y como demuestra este trabajo, también parece influir el tamaño y la procedencia de la biopsia conjuntival. Respecto al tamaño, no existen hasta la fecha estudios comparativos, si bien parece lógico afirmar que lo ideal sería obtener el menor número de células necesarias para el cultivo, a fin de limitar el daño sobre la conjuntiva donante, tanto más si se plantean sucesivas intervenciones. En cuanto al origen de las stem cells conjuntivales, la controversia es aún mayor. Aunque se han propuesto numerosas localizaciones (limbo, conjuntiva bulbar y palpebral, unión mucocutánea…), los trabajos más recientes como el de Harun (Human Cell, 2011), parecen confirmar la localización de dichas células en el fórnix conjuntival.
Quizás el principal beneficio del uso de explantes para la expansión ex vivo sea que las stem cells permanecen en su microambiente, donde las células vecinas, los fenómenos de interacción intercelular y la propia matrix extracelular (MEC), parecen jugar un papel esencial en la función de estas singulares células. Es posible que la mayor capacidad de crecimiento de los explantes procedentes del fórnix se deba a la diferente composición de la MEC entre unas zonas y otras de la conjuntiva. Del mismo modo, quizás el tamaño del explante influya en la capacidad de crecimiento debido a la diferente cantidad de factores estimulantes e inhibidores del crecimiento presentes en la MEC de cada muestra.
Pese a que los explantes pequeños muestran un crecimiento proporcionalmente mayor que los grandes y, por tanto, un mayor número de divisiones celulares al cabo de los 8 días de cultivo, presentan un menor porcentaje de células p63+/PCNA+ (marcadores de alta proliferación celular) en la IHQ. Los autores justifican este hallazgo aparentemente contradictorio asumiendo que el mayor número de divisiones permitiría a las células de estos explantes alcanzar antes la senescencia, volviéndose p63-/PCNA-.
Conclusiones
Los explantes obtenidos del fórnix conjuntival parecen mostrar el mayor rendimiento en cultivo, sugiriéndose como el origen óptimo de las biopsias conjuntivales. Por otro lado, el uso de explantes pequeños resultaría más efectivo para la expansión ex vivo en comparación con aquellos de mayor tamaño, lo que reduciría a su vez el daño sobre el tejido donante.
Autora:
Raquel Salazar Méndez